첨단 계산 도구를 활용하여 아미노산 서열을 변경하지 않으면서 PAM 서열을 방해하는 무작위 돌연변이를 설계합니다. 온도 민감성 검증은 허용 온도와 제한 온도에서 성장 속도 또는 단백질 활성을 측정하는 표현형 분석과 기능적 염기서열 분석을 병행하여 수행합니다. 예를 들어, 온도 민감성 BRAF 변이체는 다양한 온도 조건에서 p-ERK 웨스턴 블롯을 통해 MAPK 경로 활성을 평가합니다.

BRAF V600E의 기능 및 MAPK 경로 활성화는 인산화된 ERK(p-ERK)에 대한 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인합니다. p-ERK는 주요 경로 마커입니다. 또한, BRAF V600E 돌연변이를 특이적으로 검증하기 위해 VE1 항체 염색을 수행합니다. 이러한 검증을 통해 편집된 세포가 예상되는 경로 활성화를 보임을 보장하며, 이는 치료 반응을 정확히 모델링하는 데 필수적입니다.

다중 gRNA 설계를 복합적으로 활용하고, 싸이아젠(Cyagen)의 독자적인 α-donor 시스템을 적용하여 단일 엑손 내 다수의 변이를 도입합니다. 정밀한 편집을 보장하고 인접한 조절 요소의 손상을 방지하기 위해 동형 재조합(HDR)을 활용합니다. 편집 후 확인 과정에는 산소측정법(Sanger sequencing) 및 기능 검사(예: TP53 엑손-6 절단 변이에 대한 CypD 상호작용 검사)를 포함하여 유전체의 무결성을 유지합니다.

싸이아젠(Cyagen)은 유전자 변형 구성 요소의 전달 방식을 최적화하여 세포 스트레스를 최소화하고, 독자적인 α-donor 시스템을 활용한 Footprint-Free 편집을 통해 다능성 유지에 중점을 둡니다. 편집 후 검증은 OCT4, NANOG, SOX2에 대한 면역형광 염색을 포함합니다. 기본 보고서에는 면역형광 이미지가 포함되며, 요청 시 줄기성 검증을 위한 정량적 유세포분석(Flow Cytometry) 데이터도 제공할 수 있습니다.

네, 싸이아젠(Cyagen)의 세포 유전자 편집 시스템과 타겟 유전자 편집 기술을 통해 HCT116 세포에서 MSI 상태를 유지한 채 정확한 동형접합 KRAS G12D 돌연변이를 구축할 수 있습니다.
편집 후 MSI 안정성 검증은 PCR-모세관 전기영동(PCR-Capillary Electrophoresis)을 이용해 BAT25, BAT26을 포함한 5개 미소위성 좌위를 분석하는 방식으로 수행하며, 이는 표준화된 대장암 연구 프로토콜을 따릅니다. 이를 통해 유전자 편집 과정에서 의도치 않은 유전체 교란이 발생하지 않았음을 확인합니다.